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四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）, 2020, 51(2): 139-145. doi: 10.12182/20200360506

用于新型冠狀病毒肺炎防治的生物制品研究策略

Column: Spotlights on COVID-19

Biological Product Development Strategies for Prevention and Treatment of Coronavirus Disease 2019

• YAN Cai-xia1,
 
• LI Jia1,
 
• SHEN Xin1,
 
• LUO Li2,
 
• LI Yan1, , ,
 
• LI Ming-yuan3

• 1.

  State Key Laboratory of Oral Diseases , National Clinical Research Center for Oral Diseases，West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China

• 2.

  Chengdu Institute of Biological Products, Chengdu 610023, China

• 3.

  Department of Medical Microbiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China

Corresponding author: LI Yan, feifeiliyan@163.com ;

四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）, 2020, 51(2): 139-145. doi: 10.12182/20200360506

用于新型冠狀病毒肺炎防治的生物制品研究策略




摘要: 新型冠狀病毒，又稱嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2），它引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）目前已成為全球關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。SARS-CoV-2感染人數(shù)眾多，傳播性極強(qiáng)，病死率較高，亟需尋求安全高效的特異制劑用于病毒感染的防治。目前在烈性傳染病防治中廣泛應(yīng)用的生物制品，在阻斷SARS-CoV-2感染上同樣極具潛力。本文根據(jù)嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome, SARS）和中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome, MERS）已有的防治策略及研發(fā)進(jìn)展，對(duì)干擾素、恢復(fù)期血漿、腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、疫苗、抗體等生物制品的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)和研發(fā)命運(yùn)進(jìn)行綜述，為早日攻克COVID-19提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞: 
• 新型冠狀病毒 / 
 
• 新型冠狀病毒肺炎 / 
 
• 嚴(yán)重急性呼吸綜合征 / 
 
• 中東呼吸綜合征 / 
 
• 生物制品 

Abstract: Coronavirus disease 2019 (COVID-19) caused by the novel coronavirus, also known as severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-Cov-2), has become a Public Health Emergency of International Concern. Due to the large infection population, broad transmissibility and high mortality, it is urgent to find out the efficient and specific methods to prevent and treat COVID-19. As biological products have broadly applied in the prevention and treatment of severe epidemic diseases, they are promising in blocking novel coronavirus infection. According to the research advances of severe acute respiratory syndrome (SARS) and Middle East respiratory syndrome (MERS), we reviewed the potential application of biological products such as interferon, convalescent plasma, intestinal micro-ecological regulators, vaccines and therapeutic antibodies, etc. , on prevention and treatment of COVID-19. May this review be helpful for conquering COVID-19 in the near future.

Key words: 
• SARS-CoV-2 / 
 
• COVID-19 / 
 
• SARS / 
 
• MERS / 
 
• Biological products 




根據(jù)2015版中國(guó)藥典的定義，生物制品是指以微生物、細(xì)胞、動(dòng)物或人源化組織和體液為原材料，應(yīng)用生物學(xué)技術(shù)制備，用于預(yù)防、治療和診斷人類疾病的制劑，如疫苗、血液制品、生物技術(shù)藥物、微生態(tài)制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、診斷制品等。國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中指出[1]，將α-干擾素霧化納入一般抗病毒療法，康復(fù)者血漿用于重型、危重型患者治療，腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑可用于輔助治療措施，兒童重癥、危重型病例可酌情考慮使用靜脈滴注丙種球蛋白。針對(duì)病毒有可能長(zhǎng)期存在的預(yù)期，最有效的預(yù)防方法就是研制特異性的疫苗，而中和性抗體將是特效治療制劑。目前全國(guó)正在爭(zhēng)分奪秒的研發(fā)特效生物制劑，期望通過疫苗的主動(dòng)免疫和特異性抗體的被動(dòng)免疫，有效防治新型冠狀病毒肺炎，盡快消除疫情。有效和特異—這兩種優(yōu)點(diǎn)將生物制品置于防控領(lǐng)域重點(diǎn)研發(fā)和潛在應(yīng)用的焦點(diǎn)。本文以2003年暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome, SARS）和2012年暴發(fā)的中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome, MERS）疫情為鑒，選擇可能對(duì)新型冠狀病毒肺炎具有防治作用的生物制品進(jìn)行全面綜述。

新型冠狀病毒又名嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2），由其引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 19, COVID-19）自2019年12月起在湖北省武漢市暴發(fā)，隨即迅速席卷全國(guó)，目前已在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)確診病例。SARS-CoV-2屬于β屬冠狀病毒[2]，與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV）同屬β屬b譜系，在全基因組序列上有79%左右的相似性，受體結(jié)合域（receptor binding domain, RBD）同源性達(dá)到73%，是SARS-CoV的姊妹病毒，但兩者編碼的附屬蛋白有差異，如SARS-CoV-2缺乏8a蛋白，編碼的8b蛋白（121個(gè)氨基酸）的長(zhǎng)度要長(zhǎng)于SARS-Cov（84個(gè)氨基酸），3b蛋白也存在差異，總體上差異380個(gè)氨基酸位點(diǎn)[3]。而且SARS-CoV-2編碼的刺突蛋白（spike protein, S）與血管緊縮素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-converting enzyme 2, ACE2）的平衡解離常數(shù)為14.7 nmol/L，提示其親和力（與平衡解離常數(shù)呈反比）比 SARS-CoV（325.8 nmol/L）高22倍左右。S蛋白及其輔助蛋白組成和功能的差異，部分解釋了兩種病毒在傳染強(qiáng)度、肺炎病癥、致死率等方面明顯不同的原因。中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS‐CoV）屬于β屬c群，與SARS-Cov-2的全基因組序列相似性為50%左右，S蛋白及RBD區(qū)與SARS-CoV-2差異很大。目前認(rèn)為3種冠狀病毒的自然宿主均為蝙蝠，其中SARS-CoV的中間宿主為果子貍，MERS-CoV的中間宿主是駱駝，而SARS-CoV-2的潛在中間宿主為穿山甲。

1.   廣譜抗病毒生物制品

1.1   干擾素

動(dòng)物細(xì)胞受到某些病毒感染后會(huì)分泌具有抗病毒功能的宿主特異性蛋白質(zhì)（主要為糖蛋白），稱為干擾素（interferon, IFN）。IFN是廣譜的抗病毒生物制劑，傳統(tǒng)方法通過血源提取制備，現(xiàn)廣泛應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。目前人體產(chǎn)生的已知IFN共有13種，分為IFN-α、β、γ、λ等，其中IFN-α由固有免疫細(xì)胞分泌，在病毒感染的早期即可控制病毒的生長(zhǎng)和繁殖。在抗擊SARS和MERS時(shí)期，IFN與其他藥物的聯(lián)合得到廣泛應(yīng)用。INF-α聯(lián)合利巴韋林已成功應(yīng)用于SARS的初級(jí)預(yù)防和治療，治療MERS-CoV感染的動(dòng)物模型同樣有效[4]，但AL-TAWFIIQ等[5]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)用對(duì)MERS-CoV感染患者并沒有達(dá)到理想的治療效果，其推測(cè)可能與給藥時(shí)間不同有關(guān)。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》推薦，可嘗試將INF-α霧化吸入，或與洛匹那韋/利托那韋聯(lián)合應(yīng)用于COVID-19的一般抗病毒治療。也有人嘗試進(jìn)行INF-α皮下注射給藥。例如，陳岷等[6]通過對(duì)SARS和MERS臨床治療相關(guān)的文獻(xiàn)檢索篩選，納入3篇指南、8篇臨床研究進(jìn)行回顧性分析，評(píng)價(jià)皮下注射INF-α在COVID-19治療中的可能性，他們認(rèn)為：①皮下注射IFN-α應(yīng)盡可能在確診冠狀病毒感染后48 h使用，因?yàn)殡S著用藥時(shí)間與確診時(shí)間的延長(zhǎng)，有效率會(huì)降低。②各類型IFN的治療效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③皮下注射IFN-α與利巴韋林口服聯(lián)合使用在個(gè)別研究中證實(shí)有效，但仍需要警惕其不良反應(yīng)。

目前有報(bào)道，細(xì)胞因子如IFN-β和IFN-γ也可以刺激ACE2的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)（而不是對(duì)抗）病毒的感染和播散[7]。針對(duì)這一報(bào)道，我們認(rèn)為，首先，IFN的抗病毒作用肯定且經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)間的考驗(yàn)；其次，該研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察到了IFN刺激ACE2表達(dá)這一現(xiàn)象，但需要進(jìn)一步證實(shí)，而且該研究也沒有報(bào)道IFN-α是否具有此作用。我們推測(cè)，IFN抗病毒作用在前，促受體表達(dá)在后。例如一篇研究[8]報(bào)道了SARS-CoV感染小鼠引起炎性介質(zhì)在肺中雙相表達(dá)，與兩波炎性細(xì)胞募集有關(guān)。感染第2—3天，被感染的肺泡細(xì)胞等分泌大量的因子IFN-α等，pDC等固有免疫系統(tǒng)的激活似乎在控制SARS-CoV復(fù)制中起重要作用。但是在感染第7天，細(xì)胞因子IFN-γ等增高，強(qiáng)烈的病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)（尤其是CD4+ T細(xì)胞）與之有關(guān)。因此在感染的晚期，白細(xì)胞介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)可能有助于清除SARS-CoV，但也可能導(dǎo)致炎癥風(fēng)暴發(fā)生[8]。這就提示IFN的種類和應(yīng)用時(shí)期很重要。在冠狀病毒感染早期，應(yīng)用IFN-α主要是誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)，對(duì)預(yù)防和緊急治療感染更有價(jià)值。而IFN-γ主要用于免疫調(diào)節(jié)而不是抗病毒作用。再者，通過揭示COVID-19患者“炎癥風(fēng)暴”發(fā)現(xiàn)與SARS和MERS不同，IFN-γ這個(gè)指標(biāo)在COVID-19輕、重癥組并無顯著差異[9]。而IFN-β在細(xì)胞中表達(dá)量少，且中國(guó)藥典目前并未收錄這一制劑。

基因工程重組人IFN-ω最初是對(duì)IFN-α不敏感的乙型和丙型肝炎的治療用藥，但經(jīng)過重新實(shí)驗(yàn)和評(píng)價(jià)，認(rèn)為它能夠在一定程度上抑制SARS-CoV，因此在SARS期間制成鼻噴劑供部分醫(yī)務(wù)人員預(yù)防使用，起到了有效阻斷病毒感染的作用[10]。

1.2   靜脈注射人免疫球蛋白

靜脈注射人免疫球蛋白簡(jiǎn)稱靜丙，生產(chǎn)原料主要來源于數(shù)千名健康捐獻(xiàn)者所捐獻(xiàn)的血漿，具有廣泛的細(xì)菌和病毒抗體譜。大劑量的靜丙應(yīng)用可在短期將患者體內(nèi)免疫球蛋白G（IgG）水平提高2～3倍，是臨床廣泛采用的一種廣譜抗病毒方法，也是一種被動(dòng)免疫療法。SARS時(shí)期香港醫(yī)院對(duì)12例重癥患者使用了靜丙治療，6 d后患者影像學(xué)評(píng)分和需氧量均提高，10例患者經(jīng)治療后康復(fù)，且沒有不良事件的報(bào)告[11]。新加坡的一家醫(yī)院采用甲潑尼龍（200 mg）和靜丙（0.4 g/kg）聯(lián)合用于16例重癥SARS患者治療，連用3 d后，與未用藥組相比其調(diào)整死亡危險(xiǎn)比為0.41（95% CI 0.14～1.23, P=0.11），而且病情有更早恢復(fù)的跡象[12]，但仍需要通過循證醫(yī)學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)—設(shè)計(jì)大樣本的隨機(jī)、雙盲、對(duì)照并執(zhí)行嚴(yán)格的研究參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行臨床試驗(yàn)。靜丙對(duì)MERS 和COVID-19的治療作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

2.   恢復(fù)期患者血漿

對(duì)于傳染病治療，有一種非常傳統(tǒng)而古老的方法，就是采用恢復(fù)期患者血漿進(jìn)行輸血療法，是一種被動(dòng)免疫治療?；驹硎腔颊吒腥静≡w后，通過自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)病原體的抗體，獲取這些血漿抗體用于新患者，殺滅其體內(nèi)病原體。這一治療方法已在SARS-CoV和MERS-CoV感染患者中得到了應(yīng)用。2005年，YEH等[13]對(duì)3名感染了SARS-CoV的醫(yī)務(wù)人員在發(fā)現(xiàn)病情后的第10或11 d采用了恢復(fù)期血漿療法，在輸注恢復(fù)期血漿24 h后，血液檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)病毒低于檢測(cè)限，且體溫下降、肺部病變改善。MAIR-JENKINS等[14]運(yùn)用Meta分析，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)期血漿療法可降低SARS絕對(duì)病死率7%～23%，且在發(fā)病后14 d內(nèi)接受治療效果越好，沒有不良反應(yīng)事件或并發(fā)癥相關(guān)的報(bào)告。KO等[15]對(duì)3例MERS患者進(jìn)行治療，有2例表現(xiàn)出中和活性，建議在8~14 d內(nèi)使用抗體滴度≥1∶80恢復(fù)期血漿治療為好，這也為COVID-19恢復(fù)期血漿療法提供了一個(gè)參考。但是這些研究因?yàn)槿狈?duì)照組，被認(rèn)為不能從患者共患其他疾病、疾病階段或其他治療的影響中辨別恢復(fù)期血漿的療效。

恢復(fù)期患者特異性血漿抗體一般可以存留6個(gè)月、一年或更長(zhǎng)時(shí)間，并可能對(duì)同類病毒具有交叉保護(hù)性。MARKUS等[16]就發(fā)現(xiàn)，來自恢復(fù)期SARS患者的血清可交叉中和SARS-CoV-2，從而防止病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵入。針對(duì)COVID-19重癥患者采用恢復(fù)期血漿進(jìn)行治療或許是一種行之有效的方法。目前已開展了康復(fù)患者免疫血漿制品和免疫球蛋白的制備，經(jīng)過嚴(yán)格的血液生物安全性檢測(cè)、病毒滅活、抗病毒活性檢測(cè)等，已成功制備出用于臨床治療的免疫血漿。COVID-19康復(fù)者恢復(fù)期血漿臨床治療方案（試行第二版）建議檢測(cè)新型冠狀病毒血清IgG抗體定性呈反應(yīng)性，定量抗體滴度不低于160，IgM抗體呈非反應(yīng)性。適應(yīng)癥為病程不超過3周，且病情進(jìn)展較快、重癥、危重癥COVID-19患者[17]。有報(bào)道稱[18]，截止2月底，全國(guó)已采集了544人次的血漿用于245例患者的臨床治療。對(duì)其中157例患者超過48 h的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，91例患者的臨床指標(biāo)和癥狀都有一些改變，但其安全性仍是值得考量和權(quán)衡的問題。相關(guān)專家建議，有必要將恢復(fù)期血漿和某一種或幾種細(xì)胞因子的拮抗劑形成協(xié)同治療組合，比如抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴的妥珠單抗，已納入試行第七版診療方案中。

3.   腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑

人體腸道微生物組是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)、深受環(huán)境影響并與人體生理狀態(tài)互動(dòng)的微生態(tài)系統(tǒng)。SARS-CoV-2通過細(xì)胞受體ACE2進(jìn)入宿主細(xì)胞。ACE2不僅在肺部組織表達(dá)，而且在消化系統(tǒng)中表達(dá)，單細(xì)胞測(cè)序顯示在回腸和結(jié)腸細(xì)胞表達(dá)最高，而胃部細(xì)胞的表達(dá)整體偏低[19]?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》也明確指出，確診患者糞便可檢測(cè)出新型冠狀病毒核酸。從目前收治的患者情況看，死亡病例多見于患有基礎(chǔ)病的中老年患者。隨著年齡的增加，老年人群腸道微生態(tài)穩(wěn)定性和多樣性下降，致病菌比例上升，益生菌比例下降，導(dǎo)致腸道代謝吸收功能減弱、黏膜修復(fù)屏障功能受損、免疫系統(tǒng)功能下降，全身性感染的風(fēng)險(xiǎn)增高。因此，對(duì)于病毒引起繼發(fā)細(xì)菌感染或抗生素應(yīng)用導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)等情況，可嘗試使用腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，維持腸道微生態(tài)平衡。QIN等[20]通過宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，抗病毒物質(zhì)、益生菌及抗生素治療可以提高H7N9患者腸道有益菌的微生物多樣性及豐度。目前已有相關(guān)機(jī)構(gòu)對(duì)益生菌制劑調(diào)控COVID-19腸道功能及菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行臨床研究。常見的微生態(tài)制劑包括乳酸桿菌、雙歧桿菌及益生菌合劑。值得注意的是在中國(guó)專家共識(shí)中，若需同時(shí)應(yīng)用抗菌藥物，應(yīng)加大益生菌劑量或錯(cuò)開服藥時(shí)間，或選用對(duì)抗菌藥物不敏感的布拉氏酵母菌、酪酸菌和芽胞桿菌制劑[21]。近年來呼聲高漲的來自健康人群的糞菌移植可能對(duì)患者也有治療潛力。

4.   預(yù)防性疫苗

目前控制疾病流行最有效的方式是采用疫苗接種易感人群，因此研制一種安全有效的疫苗至關(guān)重要。隨著新型冠狀病毒基因組全序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，以及病毒分離株原始種子的篩選，多種疫苗如滅活疫苗、亞單位疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗等均在緊急研發(fā)中。

4.1   滅活疫苗

病毒分離株經(jīng)適應(yīng)性培養(yǎng)，經(jīng)過鑒定生物學(xué)特性、免疫原性和遺傳穩(wěn)定性后再通過滅活工藝（如使用甲醛、紫外線和β-丙內(nèi)酯）制成的全病毒疫苗[22-23]。國(guó)內(nèi)曾制備出甲醛滅活的SARS疫苗，免疫恒河猴后可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，Ⅰ期人體臨床試驗(yàn)顯示初步效果，36名受試者中有24名產(chǎn)生了抗體，但由于疫情結(jié)束未能開展Ⅱ期臨床試驗(yàn)而擱淺[24]。目前國(guó)內(nèi)多家研究單位成功分離了病毒，并進(jìn)行了種子毒株的篩選，正在進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)。滅活疫苗的優(yōu)勢(shì)在于制備簡(jiǎn)單，疫苗表面含有多種抗原蛋白能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別，能夠產(chǎn)生和病毒感染相似的抗原性。但由于需要大量擴(kuò)增病毒，制備過程有感染的風(fēng)險(xiǎn)，病毒的其他蛋白也可能引起其他有害的免疫和炎癥反應(yīng)。

4.2   亞單位病毒疫苗

采用重組基因技術(shù)制備亞單位疫苗，具有安全性更高、穩(wěn)定性更好，可快速實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢(shì)。冠狀病毒S蛋白含有大量的抗原決定簇，在誘導(dǎo)中和抗體和T細(xì)胞免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，因此S蛋白是SARS疫苗最有潛力的靶目標(biāo)。S蛋白由兩個(gè)亞基組成，S1亞基含有RBD，是主要的抗原表位，S2亞基可介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的融合[25]?；赟ARS-CoV S蛋白的疫苗已有多家報(bào)道[26]，發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)S蛋白三聚體對(duì)小鼠或倉(cāng)鼠進(jìn)行疫苗接種可保護(hù)這些動(dòng)物免受SARS-CoV的感染，S蛋白可誘導(dǎo)小鼠和非洲綠猴血清中中和抗體的產(chǎn)生。更進(jìn)一步，ZHOU等[27]采用S1亞基的485-625和S2亞基1029-1192的表位多肽作為疫苗，可以誘導(dǎo)中和反應(yīng)，使抗體水平增加。對(duì)MERS-CoV而言，大部分疫苗策略多聚焦在S蛋白S1亞基和RBD上，通過RBD重組蛋白多肽或者與人抗體FC片段結(jié)合成融合蛋白來制備抗原[28]。不過，由于SARS-CoV-2和SARS-CoV是姊妹病毒，結(jié)構(gòu)相似性高但也存在編碼蛋白的差異，因此基于兩種病毒的S蛋白重組載體和生物信息學(xué)篩選的通用S抗原表位，研發(fā)可同時(shí)中和兩種病毒的通用疫苗更有價(jià)值。

SARS病毒表達(dá)的其他蛋白如膜蛋白（membrane protein, M）、包膜蛋白（envelope protein, E）也能表達(dá)在病毒的表面，在患者血清中可以檢測(cè)到相應(yīng)的保護(hù)性抗體。核衣殼蛋白（nucleocapsid protein, N）與RNA結(jié)合位于病毒核心，相對(duì)保守，多用于SARS-CoV-2的檢測(cè)，但也可以作為候選疫苗[25]。雖然抗N抗體在體外沒有病毒中和活性，但N蛋白能在體內(nèi)誘導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)，給免疫動(dòng)物提供保護(hù)。因此，除了S蛋白，SARS-CoV-2其他結(jié)構(gòu)蛋白E、M和N均有潛力作為候選疫苗。

4.3   重組病毒載體疫苗

重組病毒載體疫苗是將外源保護(hù)性抗原基因插入到病毒基因組內(nèi)獲得重組蛋白表達(dá)的一類載體疫苗。重組病毒載體疫苗具有插入外源基因長(zhǎng)、接種途徑多及易生產(chǎn)制備等優(yōu)點(diǎn)，已在疫苗研制中廣泛開展。常用的病毒載體包括腺病毒、痘苗病毒、副流感病毒等[29]。如將SARS病毒S和N編碼基因與腺病毒載體重組后免疫獼猴，能分別產(chǎn)生針對(duì)S蛋白的中和抗體和針對(duì)N蛋白的T細(xì)胞反應(yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)IFN-γ分泌增加。用減毒的副流感病毒作為載體編碼SARS-CoV S蛋白免疫非洲綠猴同樣能誘導(dǎo)特異性中和抗體產(chǎn)生。將S基因?qū)霚p毒痘苗病毒載體，免疫小鼠、兔和猴以后，均能誘導(dǎo)高水平中和抗體，將動(dòng)物血清稀釋103～104仍能抑制50%的病毒。而將其中免疫老鼠的血清被動(dòng)免疫幼鼠，同樣可以保護(hù)幼鼠抵抗病毒攻擊。預(yù)防MERS感染的病毒載體疫苗設(shè)計(jì)與SARS病毒類似[28]。不同的是，MERS冠狀病毒S蛋白通過結(jié)合病毒天然受體（DPP4）感染宿主細(xì)胞，但普通的小鼠無該受體，因此需要在攜帶有人源DPP4基因的轉(zhuǎn)基因小鼠驗(yàn)證其抗原性和免疫原性。借鑒于SARS和MERS疫苗研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，已有多個(gè)團(tuán)隊(duì)正在開展SARS-Cov-2重組病毒載體疫苗研制。

4.4   核酸疫苗

核酸疫苗（DNA/mRNA）也稱基因疫苗，是指將含有編碼蛋白的基因序列直接構(gòu)建重組載體，經(jīng)肌肉注射或微彈轟擊等方法導(dǎo)入宿主體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防疾病的目的。這種蛋白直接在體內(nèi)合成，可以大大節(jié)約疫苗制備時(shí)間。YANG等[30]開發(fā)的基于SARS病毒S蛋白的DNA疫苗也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得了良好的效果，發(fā)現(xiàn)接種疫苗的小鼠肺部病毒的復(fù)制減少了106數(shù)量級(jí)以上。另外一項(xiàng)SARS的S、N、M蛋白的DNA疫苗比較研究顯示，上述疫苗都能產(chǎn)生不同類別的免疫反應(yīng)，其中S蛋白誘導(dǎo)的體液免疫較強(qiáng)，而M蛋白引起的細(xì)胞免疫更強(qiáng)。因此，有必要進(jìn)一步評(píng)估M抗原及其他輔助蛋白的潛在作用[31]。GLS-5300是首個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)基于MERS-CoV S蛋白全長(zhǎng)序列的候選DNA疫苗，在小鼠、駱駝和恒河猴中都能誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和特異性中和抗體反應(yīng)，可以一定程度上保護(hù)恒河猴免受MERS-CoV的攻擊，未出現(xiàn)臨床和影像學(xué)上肺炎的特征。Ⅰ期臨床試驗(yàn)顯示GLS-5300具有可耐受的安全性和穩(wěn)健的免疫原性[32]。與DNA疫苗相比，mRNA疫苗是一種新型核酸疫苗，可以向患者體內(nèi)直接遞送mRNA，利用患者細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)元件直接翻譯出蛋白片段。部分mRNA疫苗本身具有的疫苗佐劑特性，通過產(chǎn)生多種細(xì)胞因子等不同方式刺激免疫系統(tǒng)，加大抗體合成能力，在新型疫苗制備上具有極大的應(yīng)用價(jià)值[33]。

核酸疫苗制備時(shí)間短，但尚未有完成臨床試驗(yàn)的成品疫苗，也未見文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)SARS-CoV-2的研發(fā)嘗試，仍值得深入探索；傳統(tǒng)滅活或減毒疫苗，制備時(shí)間長(zhǎng)，但技術(shù)相對(duì)成熟，目前上市的疫苗多為此類。重組蛋白抗原在體外制備，安全可控，可以快速實(shí)現(xiàn)應(yīng)急疫苗的量產(chǎn)。上述不同制備方式的疫苗，目前均在緊急研發(fā)中。

5.   治療性抗體

目前，全球治療性抗體的銷售市場(chǎng)以年均32%的速度增長(zhǎng)，在生物類藥物中增長(zhǎng)最快[34]。治療性抗體的顯著優(yōu)勢(shì)是相對(duì)安全，同時(shí)具有功能強(qiáng)大和靶向性高的特點(diǎn)，是烈性病毒感染防控的特效藥物，例如已經(jīng)研制出的針對(duì)埃博拉的抗體藥物ZMapp就取得了很好的效果[35]。

5.1   特異性IgG抗體

針對(duì)病毒的中和抗體IgG一旦產(chǎn)生，不但量大而且持久，從而能有效地阻斷病毒再次進(jìn)入機(jī)體內(nèi)。一項(xiàng)針對(duì)SARS愈后的34名醫(yī)務(wù)工作者前瞻性研究顯示，此后的12年每年檢測(cè)他們的抗SARS-CoV IgG滴度仍保持在很高的水平，提示IgG的存在可能提供針對(duì)該病毒再感染和其他β冠狀病毒（如SARS-CoV-2）感染的保護(hù)能力[36]。除了多克隆抗體外，單克隆抗體（簡(jiǎn)稱單抗）也是該領(lǐng)域最受矚目的發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)，常規(guī)用雜交瘤技術(shù)，可產(chǎn)生高度均一、特異性高的抗體。目前針對(duì)冠狀病毒的單克隆抗體主要分為鼠源性單克隆抗體和人源化單克隆抗體，近期部分科研團(tuán)隊(duì)采用記憶B細(xì)胞單克隆抗體制備技術(shù)，也為快速制備人源化抗體帶來了希望。

5.1.1   鼠源性單克隆抗體

目前的研究常用SARS-CoV病毒RBD抗原表位免疫小鼠，提取脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，采用選擇培養(yǎng)基對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行篩選和亞克隆化培養(yǎng)，經(jīng)純化制備IgG單抗。HE等[37]制備了小鼠單克隆抗體1A5和2C5，其中2C5能夠阻止RBD與ACE2的結(jié)合。RBD有6組構(gòu)象依賴性表位，稱為Conf Ⅰ～Ⅵ，其中Conf Ⅵ和Conf Ⅴ單克隆抗體顯著阻斷了RBD融合蛋白與ACE2的結(jié)合[38]。上述小鼠單克隆抗體作為異源性蛋白，更常用于疾病診斷。

5.1.2   人源化單克隆抗體

人源性抗體可以彌補(bǔ)異源性抗體的不足。人源化單克隆抗體可通過EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因人源化小鼠技術(shù)等來實(shí)現(xiàn)。LANZAVECCHIA團(tuán)隊(duì)從一名SARS患者恢復(fù)期的血液中用EB病毒轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆技術(shù)篩選針對(duì)不同病毒結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體，其中有35種在體外具有中和活性，命名S3.1的單克隆抗體注射小鼠，攻毒實(shí)驗(yàn)顯示可抑制上呼吸道病毒復(fù)制、下呼吸道免受病毒感染[39]。SUI等[40]利用噬菌體展示技術(shù)，篩選出了靶向S蛋白名為80R的單克隆抗體，注射老鼠可減少104的病毒增殖。用同樣的方法，篩選到m396和CR3014。利用現(xiàn)有的SARS病毒單抗，評(píng)估對(duì)SARS-CoV-2交叉反應(yīng)性發(fā)現(xiàn)，某些單抗如CR3022可以與SARS-CoV-2 RBD有效結(jié)合，雖然抗原決定簇并不完全重疊。另外一些如m396、CR3014卻不能結(jié)合[41]。MERS的單克隆抗體也有多種，分離自MERS康復(fù)患者的單抗MCA1，0.39 μg/mL的質(zhì)量濃度就能夠完全中和Vero E6細(xì)胞中的MERS病毒[42]。YING等[43]通過酵母展示技術(shù)制備了MERS-4和MERS-27，細(xì)胞水平具有非常強(qiáng)的抑制病毒效果，其機(jī)制是抗體與RBD結(jié)合導(dǎo)致其中一段loop的構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而破壞受體識(shí)別關(guān)鍵區(qū)域，間接行使抗病毒功能。ZHANG等[44]開發(fā)的超強(qiáng)活性抗體m336，與MERS冠狀病毒的結(jié)合親和力常數(shù)達(dá)到“皮摩爾”級(jí)別，已經(jīng)在狨猴和兔子動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示有效。該抗體在與MERS病毒結(jié)合時(shí)，其結(jié)合面與DPP4的重疊面積高達(dá)90%以上，這一發(fā)現(xiàn)解釋了m336抗體為什么具有超強(qiáng)殺傷力。

將人類編碼抗體的基因轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失的動(dòng)物中，使動(dòng)物表達(dá)人類抗體，達(dá)到抗體全人源化的目的是一項(xiàng)新技術(shù)，具有十分明顯的優(yōu)勢(shì)，可針對(duì)不同抗原開發(fā)不同抗體，并且周期大大縮短。目前，國(guó)內(nèi)已有研究單位開展人源化抗體轉(zhuǎn)基因小鼠制備抗SARS-COV-2抗體的工作，有希望成為疫情防控的應(yīng)急抗體制劑[45]。

5.1.3   單個(gè)B細(xì)胞抗體

恢復(fù)期患者產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞是B細(xì)胞，利用最新技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其中少量有中和作用、特異性的記憶B細(xì)胞進(jìn)行抗體基因克隆后，獲得單克隆抗體，稱為單個(gè)B細(xì)胞克隆抗體，保證了輕重鏈可變區(qū)的天然配對(duì)，相較于傳統(tǒng)的抗體制備技術(shù)具有效率高、全人源、基因多樣性更豐富等優(yōu)勢(shì)[46]。借鑒寨卡病毒單個(gè)B細(xì)胞抗體的技術(shù)路線，首先通過流式細(xì)胞分選從恢復(fù)期患者外周血分離B淋巴細(xì)胞，以病毒抗原E蛋白為誘餌，用熒光標(biāo)記抗原分選到特異結(jié)合E蛋白的單個(gè)B細(xì)胞，體外反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增抗體基因，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析，再將擴(kuò)增抗體基因片段與IgG1的恒定區(qū)片段融合以生成全長(zhǎng)單克隆抗體，在真核表達(dá)細(xì)胞如HEK293中進(jìn)行抗體的表達(dá)。純化后用常規(guī)方法進(jìn)一步測(cè)定抗體與抗原的特異性、親和力以及中和活性等生物學(xué)特性[47]。

單個(gè)B細(xì)胞抗體實(shí)際上就是基因工程抗體技術(shù)，可以選擇與病毒中和性最好的抗體。相比血漿，抗體特異單一、保險(xiǎn)、確定，將該技術(shù)也應(yīng)用在H7N9和埃博拉抗體的制備中。近期有團(tuán)隊(duì)采用COVID-19康復(fù)期患者B細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序的方法，嘗試體外抗體表達(dá)生產(chǎn)。

5.2   特異性IgY抗體

卵黃抗體（immunoglobulinyolk, IgY）又稱卵黃免疫球蛋白，是指用特定的抗原免疫產(chǎn)蛋禽類后，從免疫禽蛋中獲得的針對(duì)免疫抗原產(chǎn)生的特異性抗體。胡國(guó)柱等[48]用滅活SARS-CoV免疫產(chǎn)蛋雞，制備得到特異性IgY，可用于SARS-CoV的預(yù)防及阻斷其傳播。KAMMILA等[49]利用SARS病毒的N抗原免疫產(chǎn)蛋雞，制備N特異性IgY，開發(fā)了一種快速檢測(cè)病毒感染的方法。由于IgY具有安全高效、快速制備、成本低廉特點(diǎn)，針對(duì)目前SARS-CoV-2的流行特征，可以制備其IgY，生產(chǎn)口服制劑用于殺滅消化系統(tǒng)病毒，也可制備成抗體噴劑用于手、口腔、鼻腔等進(jìn)行黏膜病毒阻斷。

6.   結(jié)語

通過對(duì)冠狀病毒SARS和MERS感染有關(guān)的生物制品的研究和應(yīng)用的回顧，對(duì)目前COVID-19疫情防控具有重要的借鑒意義。IFN、生態(tài)制劑、恢復(fù)期血漿在對(duì)癥治療中發(fā)揮重要作用，疫苗研發(fā)和治療性抗體制備當(dāng)然更被寄予厚望。期望通過應(yīng)急攻關(guān)，在科學(xué)家和生物企業(yè)等多方合作下，制備出相應(yīng)的主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫制劑，盡快打贏這場(chǎng)SARS-CoV-2病毒殲滅戰(zhàn)。

四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）, 2020, 51(2): 139-145. doi: 10.12182/20200360506

用于新型冠狀病毒肺炎防治的生物制品研究策略

引用本文:

晏彩霞, 李佳, 沈鑫, 等. 用于新型冠狀病毒肺炎防治的生物制品研究策略[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）, 2020, 51(2): 139-145. doi: 10.12182/20200360506

Citation:

YAN Cai-xia, LI Jia, SHEN Xin, et al. Biological Product Development Strategies for Prevention and Treatment of Coronavirus Disease 2019[J]. JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE EDITION), 2020, 51(2): 139-145. doi: 10.12182/20200360506